כיצד לשפר את הרגישות של תגובת RT-PCR לזיהוי RNA

בתהליך של ביצוע מחקרים גנטיים, אנו נתקלים לעתים קרובות בחוסר דגימות RNA, למשל, לחקר גידולי פה אנטומיים זעירים, אפילו דגימות של תא בודד, ודגימות של מוטציות גנים ספציפיות שמתעתקות ברמות נמוכות מאוד בתאים אנושיים.כמובן, עבור בדיקת COVID-19, אם הספוגיות לא נמצאות במקום הנכון או לא מספיק פעמים במהלך הדגימה, גודל המדגם יהיה נמוך מאוד, וזו הסיבה שהוועדה לבריאות ותכנון המשפחה יצאה לפני יומיים. עבר את הבדיקה, ואם דוגם חומצת הגרעין לא לקח שש דגימות, אתה יכול לדווח על כך.

הרגישות של המגיב חשובה כי יש לנו בעיה זו או בעיה אחרת, אז מה אנחנו יכולים לעשות כדי לשפר את הרגישות של RT-PCR?

לפני שנדון בפתרונות אפשריים, נזכיר שני סיבוכים גדולים עם המצב שהזכרנו זה עתה.

קודם כל, אנו מודאגים מאובדן RNA כאשר יש לנו רק אוכלוסיות תאים בודדות במדגם שלנו.אם נעשה שימוש בשיטות הפרדה וניקוי מסורתיות, כגון שיטת עמודה או שיטת משקעים של חומצות גרעין, קיימת אפשרות גבוהה שהדגימות המעטות יאבדו.פתרון אחד הוא להוסיף מולקולת נשא, כמו tRNA, אבל גם אז, אין ערובה שניסוי ההחלמה שלנו תקין.

אז מהי דרך טובה יותר?אפשרות טובה עבור תאים מתורבתים או דגימות מיקרואנטומיות היא להשתמש בתמוגה ישירה.

הרעיון הוא לפצל את התאים למשך 5 דקות, לשחרר את ה-RNA לתמיסה, לאחר מכן לעצור את התגובה למשך 2 דקות, ולאחר מכן להוסיף את הליזאט ישירות לתגובת השעתוק ההפוכה כך ששום RNA לא יאבד, ולבסוף לשים את ה-cDNA המתקבל ישירות לתוך התגובה בזמן אמת.

אבל מה אם, בגלל נקודת התחלה מוגבלת או כמות קטנה של ביטוי גן מטרה, נוכל למחזר את כל ה-RNA ועדיין לא לספק מספיק תבניות כדי לקבל אות טוב בזמן אמת?

במקרה זה, שלב הקדם-הגברה יכול להיות שימושי מאוד.

להלן תכנית להגברת הרגישות לאחר שעתוק הפוך.לפני שמתחילים, עלינו לשאול במורד הזרם באילו מטרות אנו מעוניינים, כדי לעצב פריימרים ספציפיים עבור מטרות אלה עבור קדם-הגברה.

ניתן להשיג זאת על ידי יצירת פריימר מעורב עם עד 100 זוגות פריימרים ומחזור תגובה של 10 עד 14 פעמים.לכן, יש צורך ב-Master Mix שתוכנן במיוחד עבור דרישה זו כדי להגביר מראש את ה-cDNA שהושג.

הסיבה לקביעת מספר המחזורים בין 10 ל-14 היא שמספר מחזורים מצומצם זה מבטיח אקראיות בין המטרות השונות, שהיא חיונית עבור חוקרים הזקוקים למידע מולקולרי כמותי.

לאחר ההגברה המוקדמת, נוכל לקבל כמות גדולה של cDNA, כך שרגישות הזיהוי בקצה האחורי משתפרת מאוד, ואף נוכל לדלל את הדגימה ולבצע מספר תגובות PCR בזמן אמת כדי למנוע שגיאות אקראיות אפשריות.